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mRNA 換咗個信封：Karikó、Weissman 同核苷修飾

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一、一個被裁走嘅匈牙利科學家

1955 年 1 月 17 日，Katalin Karikó 喺匈牙利 Szolnok 出世。屋企冇自來水，亦冇電視，更加冇乜科學背景：爸爸係屠夫，媽媽做簿記。佢讀小學已經攞生物獎，靠嘅係自己嘅好奇心同屋企嘅支持——佢憶述父母因為自己冇機會讀書，所以特別鼓勵仔女讀。都唔係個個咁幫手，曾經有老師同佢講，會確保佢入唔到大學。佢冇放棄，後來考入匈牙利數一數二嘅研究重鎮 Szeged 大學，1982 年攞到生物化學博士，之後喺 Szeged 嘅匈牙利科學院生物研究中心做核酸研究，開始接觸 messenger RNA（mRNA）。

1985 年，實驗室經費斷咗，佢決定帶住丈夫同兩歲嘅女兒移民美國。當時匈牙利政府只准佢帶 100 美元出境，於是佢喺黑市賣咗架車，將賣車得嚟、略多於 1,000 美元嘅現金縫入女兒隻泰迪熊入面帶出國——諾貝爾獎網站嘅 Karikó 專頁仲放咗張女兒攬住嗰隻熊嘅相。到咗美國，佢先喺費城嘅 Temple University 做博士後研究，之後去 Bethesda 嘅美國軍方醫科大學（Uniformed Services University of the Health Sciences），1989 年加入賓夕法尼亞大學（Penn）做助理教授，開始同 mRNA 糾纏二十幾年。

當時大部分人覺得，喺試管合成嘅 mRNA 太唔穩定，又會引起發炎，唔適合做藥。其實喺試管大量合成指定序列嘅 mRNA，技術上 1980 年代已經做得到：用噬菌體嘅 SP6 或者 T7 RNA 聚合酶，就可以由 DNA 模板大量「抄」出想要嘅 mRNA。理論上 mRNA 係一份好靚嘅「蛋白說明書」：佢唔會嵌入基因組，序列可以好快改寫，細胞質入面嘅核糖體就識得照住佢製造蛋白。但現實好殘酷。冇保護嘅 mRNA 好易被酶打散；就算送得入細胞，亦好多時會觸發強烈嘅先天免疫反應，令細胞進入「抗病毒戒備」，反而壓低蛋白產量。

Karikó 偏偏相信，如果可以叫細胞自己照住一份短暫嘅說明書開工，就唔使再靠大型細胞培養去製造疫苗或者治療用蛋白。問題係，錢同職位都好難搵。

佢後來接受 CNBC 訪問時講過，佢喺 Penn「被降職四次」。據《泰晤士高等教育》（THE）報道，佢喺 1995 年被調離教職，因為上司覺得佢嘅 mRNA 研究冇成果。2013 年，學校拒絕恢復佢原本嘅職位，佢憶述校方開完會之後話佢「唔夠教員質素」（not of faculty quality），佢就咁被迫退休離開，喺 Penn 前後做咗 24 年。呢啲細節主要來自佢本人嘅訪問同傳媒報道；Penn 冇回應 CNBC 嘅查詢，所以應該當係當事人嘅說法，而唔係校方紀錄。

重要嘅係佢冇停手。用佢自己嘅講法，降職之後佢照樣「當冇事發生咁」返實驗室，繼續改 mRNA 嘅尾部（例如加長 poly(A) 尾可以提高蛋白產量）、遞送條件同序列，一步步收窄「點解合成 mRNA 唔好用」呢個問題。

二、影印機隔籬嘅合作

轉捩點喺走廊上。1997 年，免疫學家 Drew Weissman 喺 Penn 成立自己嘅研究組。佢 1959 年喺美國麻州 Lexington 出世，1987 年喺波士頓大學攞到醫學博士同哲學博士，喺哈佛醫學院附屬嘅 Beth Israel Deaconess 醫療中心完成臨床訓練之後，去咗美國國家衛生研究院（NIH）Anthony Fauci 嘅研究組做博士後，研究愛滋病毒（HIV-1）點樣同唔同免疫細胞上嘅受體互動。去到 Penn，佢愈嚟愈集中做疫苗，特別對樹突狀細胞有興趣——呢種細胞負責偵察病原體，再啟動後天免疫，係先天同後天免疫之間嘅橋樑。

一個熟悉 RNA 生化，一個想駕馭免疫系統。1990 年代後期，兩人喺影印機隔籬傾開偈，決定一齊研究：將試管合成嘅 mRNA 送入樹突狀細胞，可唔可以借佢嘅「展示抗原」能力做疫苗？Karikó 後來形容，兩個人專長唔同，所以「不停互相教對方」。

早期嘅發現有啲反直覺。Weissman 嘅一個主要目標係愛滋病疫苗，佢想用 mRNA 教 T 細胞認出 HIV。佢哋證明，吸收咗編碼 HIV-1 Gag 蛋白 mRNA 嘅樹突狀細胞，喺試管入面可以刺激 CD4+ 同 CD8+ T 細胞反應；但同時發現，樹突狀細胞「食」咗合成 mRNA 之後會變得活躍、分泌發炎物質。初時以為係好事，因為活躍嘅樹突狀細胞更擅長啟動 T 細胞。但如果目標係注射之後大量、穩定咁製造蛋白，呢種警報就太嘈——喺小鼠身上，合成 mRNA 引起嘅發炎甚至會令動物病倒。真正嘅突破，係佢哋多問咗一句：點解細胞自己嘅 RNA 唔會引起同樣激烈嘅發炎？

三、點解冇修飾嘅 mRNA 會激嬲細胞

佢哋知道，哺乳動物細胞入面嘅 RNA，鹼基經常帶住各種化學修飾，但試管合成嘅 mRNA 就冇。會唔會正正係「冇修飾」，令細胞當佢係入侵者？

2005 年，Karikó、Buckstein、Ni 同 Weissman 喺期刊 Immunity 發表關鍵論文（據 THE 報道，有學者憶述呢項研究之前曾經被 Nature 直接退稿）。佢哋證明，試管合成嘅 RNA 會經由細胞內體入面嘅幾種感應器——類鐸受體 TLR3、TLR7 同 TLR8——觸發先天免疫。但如果合成時加入一啲天然存在嘅修飾核苷，例如假尿苷（pseudouridine，Ψ）、5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基尿苷（m5U）同 2-硫尿苷（s2U），呢啲受體嘅反應就會大幅減弱甚至消失；樹突狀細胞分泌嘅細胞激素同活化標記亦明顯減少。諾貝爾委員會嘅背景文件特別指出，其中只有修飾尿苷嗰幾款（m5U、s2U 同 Ψ）先可以完全唔令樹突狀細胞活化。

佢哋仲比較咗唔同來源嘅 RNA。細菌同線粒體嘅 RNA 會強烈刺激樹突狀細胞；但修飾核苷豐富嘅哺乳動物總 RNA 就唔會。換句話講，先天免疫系統似乎係靠「有冇核苷修飾」去分辨自己人同外來（或者細胞壞死）嘅危險訊號。呢個發現解釋咗點解單單將序列整乾淨啲唔夠，要改核苷本身先得。

用一個比喻：一封信如果信封同字跡都似本地郵局嘅，門口保安就唔會拉警報；如果信封似病毒嘅款式，警報就會響。假尿苷，同後來嘅 N1-甲基假尿苷（m1Ψ），就係幫 mRNA 換咗個信封。生物學永遠比比喻複雜，但呢個比喻抓住咗重點：問題唔止係「有冇外來 RNA」，而係「呢份 RNA 似唔似自己細胞出嘅貨」。

佢哋本來以為論文一出，電話會響過不停。Karikó 後來憶述：「乜嘢都冇發生，電話冇響，冇人理。」

佢哋冇停。2008 年，Karikó、Weissman 等人喺 Molecular Therapy 證明，含假尿苷嘅 mRNA 唔單止少啲引起發炎，喺哺乳類細胞同小鼠體內製造蛋白嘅能力都更高；經靜脈注射入小鼠之後，喺脾臟搵到嘅 mRNA 同佢編碼嘅蛋白都明顯多啲，而就算加大劑量，都只係冇修飾嘅 mRNA 先會令血清 α-干擾素大幅上升。2010 年，佢哋喺 Nucleic Acids Research 指出其中一個機制：修飾核苷減少咗一種叫 PKR 嘅酶被激活。PKR 一啟動，就會令細胞嘅蛋白合成煞停。之後佢哋亦證明，修飾核苷可以減低另一條破壞 RNA 嘅路徑（OAS 同 RNase L）；而喺合成之後加一步純化、將體外轉錄過程產生嘅雙鏈 RNA 雜質清走，可以進一步提高蛋白產量、減少免疫反應。換句話講，修飾核苷同時做咗兩件事：降低警報，同埋提高生產線嘅產量。

再進一步，2015 年 Andries 等人喺 Journal of Controlled Release 發表研究，顯示用 m1Ψ（單用或者同 m5C 一齊用）效果比當時嘅標準——假尿苷——更好：比較雙重修飾嘅 mRNA，喺細胞株入面嘅報告基因表現最多高大約 44 倍；比較單一修飾，喺小鼠體內高大約 13 倍，細胞內嘅先天免疫刺激亦更低。諾貝爾委員會嘅科學背景文件寫明，Pfizer–BioNTech 同 Moderna 兩款新冠 mRNA 疫苗，都係將尿苷全部換成 m1Ψ，用嚟避免不必要嘅發炎、提高蛋白產量，同埋令每劑可以用較高嘅 mRNA 份量。

不過功勞要分清楚。Karikó 同 Weissman 2005 至 2010 年嘅工作係平台嘅基礎；m1Ψ 成為臨床標準，係之後其他團隊優化同產業化嘅結果，兩樣唔好混成同一句功勞。

四、另一條線：負責送貨嘅脂質納米粒

仲有一件事唔可以漏。mRNA 好脆弱，喺細胞外面好易被酶打散；佢分子大、又帶負電，亦好難自己穿過細胞膜。負責「送貨」嘅，係脂質納米粒（lipid nanoparticle，LNP）。

加拿大英屬哥倫比亞大學 Pieter Cullis 嘅團隊研發咗一種「可電離」陽離子脂質：喺酸性環境下帶正電，容易包住帶負電嘅核酸；去到身體正常酸鹼度時變返接近中性，毒性就低好多。早期永久帶正電嘅陽離子脂質雖然包得住核酸，但毒性好大，正正係呢個設計解決咗呢個問題。Cullis 喺訪問中講，佢哋 2000 年代初同波士頓嘅 Alnylam 合作，用呢類脂質將 siRNA 經靜脈送入肝臟；呢條路線最終催生咗 siRNA 藥物 Onpattro（patisiran），美國 FDA 喺 2018 年 8 月 10 日批准佢用嚟治療成人遺傳性甲狀腺素運載蛋白類澱粉沉積症（hATTR）引起嘅多發性神經病變。2009 年 Cullis 等人再成立公司 Acuitas，2012 年開始試將脂質納米粒用嚟送體積大好多嘅 mRNA。

Cullis 喺 2022 年接受 Cell 訪問時憶述，大約 2014 年，Weissman 同 Karikó 主動搵佢哋合作，想試吓唔係送去肝臟，而係將 mRNA 打入肌肉做疫苗。結果脂質唔止幫手送貨：可電離脂質令肌肉同抗原呈遞細胞製造更多蛋白，仲係一種好好嘅佐劑。佢記得 Weissman 將疫苗寄俾合作者測試，對方話第一次唔信個結果，第二次都唔信，做到第三次先確認，中和抗體反應係佢見過最勁嘅。呢個成果令 BioNTech 留意到，大約 2018 至 2019 年，Acuitas 開始同 BioNTech 合作研究流感疫苗。2020 年初疫情爆發，一切轉向新冠，Acuitas 嘅脂質納米粒最終成為 Pfizer–BioNTech 疫苗嘅一部分。

所以，Karikó 同 Weissman 解決嘅係「訊息點樣唔激嬲免疫系統，又可以好好翻譯」；Cullis 一脈解決嘅係「點樣安全咁送入細胞」。兩邊都係平台嘅關鍵支柱，唔好將成支疫苗歸功於一個人。

一針打入手臂之後，細胞入面發生咩事？脂質納米粒包住修飾過嘅 mRNA，經細胞吞入，然後幫 mRNA 由內體釋放到細胞質。核糖體讀取呢份臨時說明書，短暫製造病毒嘅棘突蛋白。B 細胞認出棘突嘅形狀，開始製造抗體；T 細胞幫手清除受感染嘅細胞，同鞏固免疫記憶。mRNA 唔會入細胞核，亦唔會改寫細胞嘅 DNA，佢只係一份會自行分解嘅臨時說明書。核苷修飾令說明書夠安靜、夠耐用，先可以俾足夠劑量，又唔會引起失控嘅發炎。

五、由冷板凳到諾貝爾獎

2013 年，Karikó 離開 Penn，加入當時仲幾低調嘅德國公司 BioNTech。呢間公司 2008 年由 Uğur Şahin、Özlem Türeci 等人創辦，原本專注個人化癌症疫苗。佢喺 BioNTech 先做副總裁，後來升做高級副總裁。佢喺諾貝爾訪問入面講過，嗰九年佢不停往返美國同德國，「我 58 歲，仲係親手培養質粒、餵細胞」。佢亦講過，自己做實驗、同團隊一齊做出產品，「比做更多文書同寫更多推薦信更有意義」。Weissman 就繼續喺 Penn 研究寨卡同流感等疫苗。2017 年，佢哋同 Pardi 等人喺 Nature 發表研究，顯示單次低劑量嘅修飾 mRNA 加脂質納米粒疫苗，已經可以喺動物身上預防寨卡病毒。

2020 年疫情爆發，兩間公司用現成嘅平台，極速設計出編碼新冠病毒棘突蛋白嘅 mRNA，並採用咗 Barney Graham 喺 NIH 疫苗研究中心嘅團隊、Jason McLellan 等研究者發展嘅「融合前穩定化」棘突設計：喺棘突特定位置換入脯胺酸，令佢維持喺融合前嘅形狀，等免疫系統認住最有用嗰個樣。

第三期臨床試驗嘅結果好清楚。Pfizer–BioNTech 疫苗嘅試驗有超過四萬三千名 16 歲或以上參加者，打完第二針至少七日後，疫苗組有 8 宗有症狀確診，安慰劑組有 162 宗，預防有症狀新冠嘅效力係 95%（Polack 等，《新英格蘭醫學期刊》2020）。Moderna 疫苗組有 11 宗、安慰劑組有 185 宗，效力係 94.1%，包括重症（Baden 等，同一期刊 2021 年 2 月刊出，網上版 2020 年 12 月先發表）。兩款疫苗喺 2020 年 12 月陸續喺唔同地區獲得緊急或有條件批准。諾貝爾委員會 2023 年嘅新聞稿提到，連同其他技術嘅新冠疫苗計埋，全球已經接種超過 130 億劑，mRNA 係其中重要嘅一部分。

2023 年 10 月 2 日，Karikó 同 Weissman 一齊獲得諾貝爾生理學或醫學獎，表揚佢哋「有關核苷鹼基修飾嘅發現，令有效嘅新冠 mRNA 疫苗得以研發」。時間上啱啱好係 Karikó 被 Penn 迫走之後大約十年。獎項肯定嘅係基礎發現：點解改鹼基可以同時減少發炎同增加蛋白產量。棘突結構研究、脂質製劑、大規模生產、臨床試驗設計，同政府同企業嘅投資，都係同一條鏈上嘅其他環節。將功勞講準確，反而令個故事更有說服力。

六、點解重要，同埋要誠實講嘅限制

第一，設計速度快。有咗病毒嘅基因序列，理論上幾個星期就可以改好抗原編碼，再用同一條生產線放大，傳統疫苗路線好難比得上。

第二，平台可以擴展。流感、呼吸道合胞病毒（RSV）、寨卡、個人化癌症疫苗，以至蛋白替代療法，都喺臨床或者臨床前階段推進緊。有啲用途會繼續用修飾核苷，有啲會用冇修飾嘅 mRNA，或者環狀 RNA、自我複製 RNA 等其他做法。諾貝爾背景文件專登用一節問「係咪所有臨床 mRNA 應用都需要修飾鹼基？」，答案係唔同用途可能有唔同需要，唔係所有 mRNA 應用都一定要用同一套鹼基配方。

第三，限制都要講清楚。抗體保護力會隨時間同病毒變種而下降，需要加強劑同更新抗原。極少數嘅不良反應，例如心肌炎同心包炎，仍然要持續監察同權衡風險。超低溫冷鏈、全球生產同公平分配，亦唔係一篇論文可以解決。基礎研究打開咗門，但公共政策、監管同生產能力，決定幾多人行得過呢道門。（呢篇係科學史同研究結果嘅整理，唔係醫療建議；個人應唔應該打、幾時打邊款疫苗，應該跟醫生同本地衞生當局嘅最新建議。）

打入手臂嗰一針，真正教免疫系統嘅，唔係死咗嘅病毒，而係一份換咗信封嘅訊息。科學家花咗幾十年，先搞清楚點解舊信封會激嬲門口保安，而新信封又點樣令細胞安心開工。呢種基礎研究，往往喺冇人拍手嘅年頭完成，等到世界突然需要，先顯得不可或缺。Karikó 得獎之後講過一句幾抵記嘅說話：佢多謝嗰啲令佢日子難過嘅人，因為佢哋令佢更努力、更堅韌。

參考資料

  1. Nobel Assembly at Karolinska Institutet (2023). Press release: The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2023. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/press-release/
  2. Nobel Committee (2023). Advanced information: Discoveries concerning nucleoside base modifications that enabled the development of effective mRNA vaccines against COVID-19. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/advanced-information/
  3. Karikó K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. (2005). Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA. Immunity, 23(2), 165–175. https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074761305002116
  4. Karikó K, Muramatsu H, Welsh FA, et al. (2008). Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability. Molecular Therapy, 16(11), 1833–1840. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC2775451/
  5. Anderson BR, Muramatsu H, Nallagatla SR, et al. (2010). Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Research, 38(17), 5884–5892.
  6. Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, et al. (2015). N1-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. Journal of Controlled Release, 217, 337–344. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26342664/
  7. Polack FP, Thomas SJ, Kitchin N, et al. (2020). Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. New England Journal of Medicine, 383(27), 2603–2615. https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2034577
  8. Baden LR, El Sahly HM, Essink B, et al. (2021). Efficacy and Safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 Vaccine. New England Journal of Medicine, 384(5), 403–416. https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa2035389
  9. Learning lessons from lipids to make COVID-19 vaccines (Cheri Sirois 訪問 Pieter Cullis). Cell, 2022, 185(8), 1279–1282. https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00336-1
  10. Nobel Prize Outreach. Katalin Karikó – Facts. https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/kariko/facts/
  11. CNBC Make It (2023). Nobel Prize winner Katalin Karikó was ‘demoted 4 times’ at her old job. https://www.cnbc.com/2023/10/06/nobel-prize-winner-katalin-karik-on-being-demoted-perseverance-.html
  12. Times Higher Education (2023). Vaccine pioneers overcame rejection and demotion to win Nobel. https://www.timeshighereducation.com/news/vaccine-pioneers-overcame-rejection-and-demotion-win-nobel

延伸閱讀

  1. 諾貝爾委員會科學背景文件：https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023/advanced-information/
    關係：官方最完整嘅科學故事線，由試管合成 RNA、免疫感應器、Ψ 同 m1Ψ，講到脂質納米粒同新冠疫苗，適合對照第三、四節嘅機制部分。

  2. Sahin, Karikó 同 Türeci (2014)，〈mRNA-based therapeutics — developing a new class of drugs〉，Nature Reviews Drug Discovery：https://www.nature.com/articles/nrd4278
    關係：疫情前嘅 mRNA 平台總覽，睇得出 BioNTech 點樣由癌症疫苗嘅思路接駁到傳染病，補充第五節 Karikó 加入 BioNTech 之後嘅背景。

  3. Pardi 等 (2017)，〈Zika virus protection by a single low-dose nucleoside-modified mRNA vaccination〉，Nature：https://www.nature.com/articles/nature21428
    關係：新冠之前，修飾 mRNA 加脂質納米粒已經喺動物身上證明咗疫苗做法行得通，即係第四、五節講嘅「平台早已準備好」。

  4. Cell 2022 年 Pieter Cullis 訪問：見參考資料 9
    關係：用第一身補齊第四節「送貨」嗰一半故事，避免將成支疫苗只歸功於核苷修飾。

  5. 諾貝爾獎網站〈Women who changed science〉Karikó 專頁：https://www.nobelprize.org/stories/women-who-changed-science/katalin-kariko/
    關係：較短嘅人生故事，由匈牙利、泰迪熊到 Penn 再到 BioNTech，補返第一、五節嘅時間線同人物感受。

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